抗酸化物質

総説
肌のアンチエイジングを目的とした真皮コラーゲン増強のためのコ スメシューティカルとしてのアスコルビン酸(ビタミンC):新たな 併用療法ーティカルとしてのアスコルビン酸(ビタミンC):新たな 併用療法

Yong Chool Boo 1,2,3O
, 慶北国立大学医学部分子医学教室、41944大市中区国策坊路680、韓国;ycboo@knu.ac.kr; TeL: +82-5-3420-4946
2 BK21 PlusKNUバイオメディカル・コンバージェンス・プログラム、大学院バイオメディカル科学科、 韓国大HI?市中区国財宝山路680、41944,
3 慶北大学細胞•マトリックス研究所、41944大市中区国財宝山路680、韓国

ビタミンＣ＝アスコルビン酸(AA)は必須栄養素であり、肌の健康と美しさを守るコスメシューティカルとして大きな 可能性を秘めている。AAは、外的および内的要因による酸化ストレスを軽減し、コラーゲン遺伝子の発現と成熟 を促進することで、光老化や肌の自然な老化を緩和することが期待されている。

本総説では、コラーゲン代謝に関 連するAAの生化学的基盤、および真皮コラーゲンの増加と皮膚老化の抑制におけるAAの臨床的エビデンスについ て論じた。さらに、コスメシューティカルとしてのAAの欠点を克服し、最大の有効性を実現するために開発され た新たな戦略についても検討した。コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質は特有のアミノ酸組成を有す るため、細胞内でのその産生は特定のアミノ酸の利用可能性に影響を受ける。

例えば、コラーゲンタンパク質のア ミノ酸残基の3分の1をグリシン残基が占めており、グリシンの供給はコラーゲン合成の制限因子となり得る。実験 により、ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生を刺激する上で、グリシンアミドが各種アミノ酸およびアミ ド化アミノ酸の中で最も効果的であることが示された。したがって、コラーゲン産生プロセスの異なる段階で作用 するアミノ酸(AA)アナログとアミノ酸アナログを組み合わせることで、コラーゲン合成を相乗的に改善するこ とが可能である。この併用療法は、コラーゲン産生の増強を必要とする肌のアンチエイジングに有用であると考え られる。

キーワード:アスコルビン酸;ビタミンc ;コラーゲン;肌の老化;アンチエイジング;アミノ酸;グリシンアミド; グリシン;化粧品;コスメシューティカル

1.はじめに
壊血病の原因と治療に関する研究の中で発見されたL-アスコルビン酸(AA)(ビタミンC)は 、ヒトの生理機能において不可欠な役割を果たしている［1］。AAの生化学的機能は、主にその酸化還 元活性に関連している［2,3］〇つまり、AAは水溶液中で電子を放出して容易に酸化されるという特 性を持っているため、活性酸素種(ROS)やフリーラジカルを除去する水溶性抗酸化物質として作 用することができる［4］。また、酵素の活性部位にある金属イオンを還元することで、触媒活性を助 ける補因子としても作用する［5,6］〇さらに、AAは重要な生体分子を還元状態に保つなど、細胞生 理学や人間の健康にとって不可欠な他の機能も果たしている［7］。
コラーゲンは、私たちの体内で最も多く存在するタンパク質であり、細胞外マトリックス( ECM)の主要な構成要素です［8,9］〇コラーゲン分子は、3本の一次構造鎖がねじれた三重らせん構 造をとっており、コラーゲンタンパク質のアミノ酸配列は通常、グリシン一プロリン-x、あるいはグ リシン・X-ヒドロキシプロリンであり、ここでXはグリシン、プロリン、またはヒドロキシプロリン 
以外の任意のアミノ酸であ る［10,11］〇 28

Antioxidants 2Q22,11,1663. https://doi.org/10.3390/antioxl1091663
これまでに、いくつかの種類のコラーゲンタンパク質が知られており、アミノ酸組成や配列にはい くつかの違いがある［12,13］〇トランスフォーミング成長因子(TGF) -01は、コラーゲンの合成におい て重要かつ多様な役割を果たしている［14］〇また、コラーゲンの分解はマトリックスメタロプロテアーゼ (MMPs)によって媒介される［15,16］〇

皮膚は、さまざまな外部環境要因にさらされる器官である［17］〇内的要因と外的要因が相 互作用する過程において、皮膚は加齢に伴う様々な機能的および構造的な変性を経験する［18］〇 皮膚のコラーゲンは、80〜90%がI型、8〜12%がIII型、5%がV型で構成されている［19］〇遺伝的要因 や栄養不足によるコラーゲン合成および成熟の不足、あるいは自己免疫反応によるコラーゲン合成の 過剰な増加は、皮膚疾患を引き起こす可能性がある［20］〇外因性および内因性の皮膚老化は、一般 的に、量、種類、および
コラーゲンの構造［21,22］、これに伴し^TGF-β!の減少と
［23,24］。

アラニン(AA)は、コラーゲン生成の複数の段階に影響を及ぼすことが知られている。プロリ ルヒドロキシラーゼおよびリシルヒドロキシラーゼの必須補因子として、AAは翻訳後段階におけるコ ラーゲンの成熟に重要な役割を果たしている［25］。また、AAは細胞内でI型およびIII型プロコラーゲンの遺 伝子転写を促進することが確認されている［26,27］〇皮膚細胞内のAA濃度は、真皮コラーゲンの量および構 造的完全性と密接に関連しており、AAの欠乏は皮膚の老化を引き起こす［28,29］〇したがって、AAの 外部からの補給は、皮膚のアンチエイジングにおける有望な戦略の一つである［29］〇 一方、AAには 、酸化されやすく、皮膚への吸収が困難であるという限界がある［30］〇

本総説の目的は、肌のアンチエイジングを目的としたコラーゲン産生を促進するコスメシュー ティカル有効成分としてのAAの可能性と応用について検討することである。まず、コラーゲン代謝 に関連するAAの生化学的基盤について簡潔に論じる。次に、AAの真皮コラーゲン増強作用および皮 膚のアンチエイジング効果に関するエビデンスを概説する。最後に、AAの欠点を克服し、その臨床 的有効性を最大化するための新たなアプローチを紹介する。本総説が、先進的な皮膚アンチエイジ ング戦略の開発に必要な今後の課題を導き出す一助となることが期待される。

2. AAの生化学的特性
AAは、植物や一部の動物において複数の経路を通じて合成される［31,32］〇しかし、ヒトはAA 合成の最終段階を触媒する機能的なグルノノラクトンオキシダーゼを欠いているため、AAを合成す ることができない［33］〇 したがって、AAはヒトにとって外部から摂取しなければならない一種のビ
タミンである。外部から摂取されたAAおよびその酸化型であるデヒドロアスコルビン酸(DHA)は、 特定の輸送機構を通じて細胞内へ取り込まれる［34］〇ヒトの溶質輸送体(SLC) 23ファミリーに属するナト リウム依存性ビタミンC輸送体(SVCT)1およびSVCT2が、AAの能動輸送を媒介している［35］〇 DHAの 促進輸送は、グルコース輸送(GLUT)ファミリーに属するGLUT K GLUT 3、およびGLUT 4によっ て媒介される［36］。DHAの加水分解により2,3-ジケト-L-グルロン酸が生成され、これはさらに加水分解され てシュウ酸とLーエリスルロースとなり、脱炭酸されてL-キシロン酸またはL.リキソン酸を形成するか 、あるいは他の小分子に分解される［32］〇

AAは二酸の一種であり、
中性水溶液［37］〇 AAの酸化反応により、モノデヒドロアスコルビン酸(アスコルビルラジカル、加¢・ )およびDHAが生成される。AAは高温下で酸素と反応して容易に酸化され［38］、この反応は遷移金 属イオンによって促進される［39］〇 AAは様々な種類の活性酸素種(ROS)やフリーラジカルと急速 に反応してそれらを消去し、アスコルビルラジカルに酸化される［3］。AAと一重項酸素との反応によ り、DHAと過酸化水素が生成される［40］。a・トコフェロールは、細胞膜における脂質過酸化の連鎖反 応を媒介する脂質ラジカルを消去することで、連鎖阻止型抗酸化物質として作用する［41］〇生成され たα-トコフェロキシルラジカルはAAと反応してa・トコフェロールを再生し、その結果、AAはアスコ ルビルラジカルに酸化される。
AAは、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼなどの特定の金属酵素において、必須の補因子 として機能する［5］。2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼは、その活性部位に鉄イオンを有して おり、この反応には分子状酸素と2ーオキソグルタル酸(別名

αーケトグルタル酸とも呼ばれる)を補基として必要とする［42］〇これらの酵素は、コラーゲン代謝 や、発生、転写調節、核酸、ホルモン、脂肪酸、抗生物質の修飾など、多くの生^:学的プロセスにおいて 重要な役割を果たしている［43］。酵素の触媒反応において、AAは酸化された鉄イオンを還元状態に戻 すことで、酵素の活性や様々な生理的プロセスに影響を与える。もちろん、この反応の過程でAAは 酸化される。

AAは、アスコルビルラジカルおよびDHAから、化学的および酵素的に再生される。2分子のア スコルビルラジカルが不均化反応を起こし、DHAとAAを生成する。アスコルビルラジカルは、 モノデヒドロアスコルビン酸還元酵素活性を有する酵素により、還元型ニコチンアミドアデニ ンジヌクレオチド(NADH)の半当量とせを用いて、直接AAに還元される［44］。DHAは、グルタ チオン(GSH)がグルタチオンジスルフィド(GSSG)へ酸化される過程と連動して、デヒドロアスコルビ ン酸還元酵素活性を有する酵素によってAAへと還元される［45］〇

3. コラーゲン代謝におけるAA
コラーゲンは細胞内で合成され、いくつかの複雑な段階を経て細胞外へ分泌される［46］〇初期 段階では、コラーゲン遺伝子が核内でmRNAに転写され、これが細胞質へ輸送されてリボソームにょ って翻訳され、プレプロコラーゲン分子が合成される［47］〇プレプロコラーゲンは小胞体へ輸送され 、そこでN末端のシグナルペプチドが除去され、プロリンおよびリシン残基がヒドロキシ化され、リ シン残基の特定のヒドロキシル基がガラクトースおよびグルコースによってグリコシル化される［48］ 〇 3つのプロコラーゲン分子は、ジッパーのような折り畳みによって左巻き三重らせんを形成し、ゴ ルジ体へ輸送される［49］〇 ゴルジ体でのさらなる修飾を経て、プロコラーゲン分子の三重らせんは 分泌小胞に組み込まれ、細胞外へ輸送される［50］〇三重らせんの両端が除去されてトロポコラーゲン 分子が生成され、トロポコラーゲン分子間で共有結合が形成されることでコラーゲンフィブリルが 生じ、これがさらに束になってコラーゲン線維を形成する［51］〇

タンパク質の翻訳後修飾の一つとして、プロリン、リジン、アスパラギン、アスパラギン酸 、ヒスチジンなどのいくつかのアミノ酸残基がヒドロキシル化される［52］〇コラーゲンの場合、プ ロリンとリジンの含有量が特に高く、これらのアミノ酸残基のヒドロキシル化は、コラーゲンタ ンパク質の構造を安定化させる上で重要である。プロリン残基のヒドロキシル化は、主に・¢原子 、時には0-C原子で起こり、リジン残基のヒドロキシル化は&C
原子［53,54］〇これらの反応は、それぞれプロリル4ーヒドロキシラーゼ、プロリル3ーヒドロキシラーゼ、リシル 5ーヒドロキシラーゼと呼ばれる酵素によって触媒される［55］〇これらの2ーオキソグルタル酸依存性ジオキシ ゲナーゼは、正常に機能するためにAAを必要とするため、AAの欠乏はコラーゲンの成熟障害を引 き起こす可能性がある［56］〇

初期の研究では、AAが薬理学的用量においてコラーゲンの産生を促進することが観察されたが、その作 用機序や生理学的意義については議論が分かれている。AAは、培養ヒト真皮線維芽細胞において、非コラ ーゲン性タンパク質の合成を増加させることなく、コラーゲンタンパク質の合成を選択的に増加させること が示された［57,58］〇この効果は、I型およびIII型プロコラーゲンのmRNAレベルの上昇と関連していた ［26,59］〇 Pinne!ら［59］は、細胞内に蓄積したプロコラーゲンがプロコラーゲン合成の翻訳を阻害し、 AAがプロコラーゲンのヒドロキシル化と分泌を促進することでこの翻訳阻害を解除し、その結果、 コラーゲン遺伝子の転写が増加するという仮説を提唱した。

他の研究グループは、AAによって刺激されるコラーゲン遺伝子発現の増加を、脂質過酸化が媒 介していると提唱している［60,61］〇脂質過酸化の生成物であるマロンジアルデヒドを添加するとコラ ーゲン遺伝子発現が増加し、連鎖阻止型抗酸化物質であるαートコフェロールはコラーゲン遺伝子発現 を抑制した［60,61］〇しかし、デフェリオキサミンやエチレンジアミン四酢酸などの細胞透過性のな い鉄キレート剤は、AAによる脂質過酸化を阻害したにもかかわらず、AAによるコラーゲン合成の増 加を抑制しなかった［62］〇したがって、AAの抗酸化作用と酸化促進作用のどちらが、コラーゲン遺 伝子発現の促進作用に関与しているのかは不明である。

AAによって誘導されるコラーゲン遺伝子発現が、2ーオキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ の調節と関連しているかどうかを調べるのは興味深いだろう。もしそうであれば、低酸素誘導因子 (HIF)など、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼの多くの標的タンパク質が、コラーゲン 遺伝子発現の潜在的な調節因子として考えられるだろう［52,63］〇また、AAがSplファミリーを活性 化するかどうかも検討する価値がある。これらの転写因子は、コラーゲン遺伝子発現の正の調節因 子として知られているからである［64,65］〇 AAによるコラーゲン遺伝子発現の根底にある分子メカニ ズムを解明することは、コラーゲン産生を促進する新たな戦略の開発に寄与するだろう。

4. AAの真皮コラーゲン増強作用および肌のアンチエイジング効果に関する臨床的根拠
光老化や皮膚の自然老化は、皮膚内のAA濃度の変化を伴うのだろうか? Rhieら［66］は、若年層 (平均21.0歳)および高齢層(平均76.1歳)の韓国人を対象に、日光に曝露された前腕と、日光から保護さ れた上腕内側の表皮および真皮における抗酸化酵素および抗酸化物質の濃度の変化について報告した 〇 光老化皮膚の表皮および真皮のAA濃度は、それぞれ若年皮膚の濃度の69%および63%であり、自 然老化皮膚の表皮および真皮のAA濃度は、それぞれ若年皮膚の濃度の61%および70%であった。し たがって、光老化と自然老化の両方が表皮および真皮のAA濃度を低下させる可能性があり、外部か らの補給が皮膚の老化を遅らせるのに役立つことが示唆される。

AAの局所塗布が皮膚のコラーゲンを増加させるかどうかについて、臨床試験が実施されてきた 〇単盲検、無作為化、顔面分割、プラセボ対照の臨床試験において、閉経後の女性10名が、上腕背面 に、片側には5%AAを含む安定化W/Oエマルジョンクリームを、もう片側にはプラセボを、夜間に1 日1回、6ヶ月間塗布した［67］〇皮膚生検におけるI型およびIII型コラーゲンのmRNAレベルは、AA投 与群でそれぞれ25%および21%増加した。しかし、本研究では、皮膚から抽出可能なコラーゲン の濃度について、AA投与群と対照群との間に有意差は認められなかった。

別の臨床試験では、5% AAクリームおよび数種類のコスメシューティカル製品のうちの1つを、片 方の前腕の伸筋側に1日2回、2週間塗布し、皮膚生検標本中のプロコラーゲンIのレベルを分析した［68］〇 5% AAクリームを塗布した全19名の被験者を対象とした統計解析では、治療前のベースラインと比較し てプロコラーゲンレベルの有意な増加は認められなかった。しかし、被験者をベースラインのプロコラ ーゲンIレベルが低い群(〃=9)と高い群(〃=10)に分けると、前者の群ではAAクリームの塗布により プロコラーゲンIレベルが有意に増加した。これらの研究は、AAが皮膚のコラーゲンを増加させるのに役 立つことを示唆しており、特に、あるいは単に、AAやコラーゲンが不足している場合にその効果が現れ ることを示唆している。

AAの局所治療が皮膚の老化症状を緩和するという臨床的証拠が報告されている。19名の健康 な女性ボランティアを対象とした無作為化二重盲検プラセボ対照試験では、日光にさらされた胸の 上部および前腕に5% AAクリームを1日1回、6ヶ月間局所塗布したところ、賦形剤のみを塗布し た場合と比較して、皮膚の微細な凹凸の密度が有意に増加し、深いしわが減少し、皮膚の超微細構 造が改善された［68］〇 光老化皮膚を持つ女性被験者20名を対象としたスプリットフェイス試験では 、23.8%のAAセラムを1日1回、2週間、顔の片側にイオントフォレーシスを用いて局所塗布したとこ ろ、被験者自身の対照群として扱われたもう一方の側と比較して、治療側の色素沈着、表面のざら っき、小じわが有意に改善された［69］〇

目の周りに顕著なしわがある被験者23名を対象に、顔の片側のカラスの足跡周辺にAA含有溶解性 マイクロニードルパッチを、もう片側にプラセボパッチを12週間貼付する二重盲検•片側比較•プラセ ボ対照臨床試験を実施し、AA含有溶解性マイクロニードルパッチのしわ改善効果を評価した［70］〇 AAを配合した溶解性マイクロニードルパッチは、皮膚の刺激や感作の問題を引き起こすことなく、 目尻のしわを著しく軽減した。

二重盲検、前向き、無作為化臨床試験では、患者はレーザー皮膚リサーフェシング処置を受け た後、200 mgのAAを、成長因子を配合したコスメシューティカルを併用するか、または併用せず に局所治療を行った［71］〇治療の3ヶ月後、両群とも肌のざらつきと眼周囲のしわの平均深さに有 意な減少が認められ、AA単独で治療した群 3 = 74)と比較して、AAと成長因子を併用して治療 した群 3 = 75)の方が良好な結果を示した。
これらの研究結果は、AAの美容用途が皮膚の老化症状の緩和に役立つことを示唆しているが 、それを裏付けるには研究数が不十分であると考えられる。

5. AAと他の有効成分を配合した製剤を用いた臨床研究
化粧品分野では、複数の有効成分を組み合わせることで効果を高める試みが数多く行われています。 本稿では、AAと他の有効成分を配合した処方の、コラーゲン増強効果および肌のアンチエイジング 効果を評価した臨床試験について紹介します。
159名の被験者を対象とした二重盲検プラセボ対照無作為化試験において、大豆イソフラボン 、リコピン、AAs a•トコフェロールを含む飲料と魚油カプセルを14週間毎日摂取した閉経後の女性 において、真皮におけるコラーゲン線維の沈着増加および顔のしわの深さの減少が確認された［72］〇

AA(5%)、プロテオグリカン(3%)、モスカタローズ油(0.3%)、ポリソルベート80 (1%)、プ 口ピレングリコール(70%)、水、香料、および保存料(メチルパラベンナトリウム、エチルパラベ ンナトリウム、プロピルパラベンナトリウム;0.14%)を含む溶液を、60名の健康な白人女性を対象 とした臨床試験において、60日間毎晩顔面に塗布した［73］〇超音波画像解析の結果、この処置にょ り、コラーゲンレベルに関連する高エコー性ピクセルが有意に増加したことが示された。

健康な女性から採取した腹部皮膚サンプルを用いたex vivo実験において、AAsエルゴチオネイン、 プロテオグリカン刺激ペプチド(テトラデシルアミノブチロイルバリルアミノブチリック尿素トリ フルオロ酢酸塩)、可溶性プロテオグリカン、および低分子量ヒアルロン酸を含む美容液の局所塗 布(2mgcm-2)を10日間行ったところ、毎日UV/可視光/赤外線(10Jcm~2)を照射した場合や、毎 日ヒドロコルチゾン(lOpgmLT)を投与した場合に誘発されるコラーゲン、エラスチン、およびプ ロテオグリカンのレベル低下を著しく抑制した［74］〇

50名の女性ボランティアを対象とした片側比較無作為化比較試験において、AA(20%)、αー卜 コフェロール、およびラズベリー葉細胞培養エキスを含むカプセル化美容液を顔の片側に2ヶ月間局所塗 布した結果、肌のアンチエイジング効果(肌の色調、弾力性、輝き、滑らかさ、角質、しわの改善) が実証された［75］〇
ある非盲検試験では、AA (15%)、αートコフェリルアセテート、パルミトイルトリペプチドー 38(5 ppm)、およびその他の成分を含む美容液を1日1回、56日間にわたって顔に塗布したところ 、肌のざらっきが8%減少し、肌のトーン(赤み9%減少、均一性8%増加)が改善した［76］。

AA (10%)、バイオペプチド(米およびルピナス由来)、ヒアルロン酸、およびヴィシー火山性ミネ ラルウォーターを配合し、防腐剤を含まない本製剤は、3つの連続した臨床試験で検証され、未処理の 皮膚と比較して皮膚細胞のターンオーバーを促進することが示されました(ダンシルクロリドプローブ の累積蛍光スコア:59.6対64.9)(被験者32名、3週間)、目尻、額、鼻唇溝のしわの臨床グレードをそれぞ れ9%、11%、5.2%低減させること(被験者40名、4週間)、および目尻のしわの数を11.5%、その最 高点と最低点の間の最大垂直距離を13%減少させること(52名の被験者において、29日後のベース ラインと比較)［77］〇

これらの臨床結果は、AAを含むいくつかの配合物が、皮膚のコラーゲンを増やし、肌の老化 を遅らせるのに役立つ可能性があることを示唆している。試験対象となった配合物にはAAを含む複 数の有効成分が含まれていたため、その効果がAAによるものなのか、それとも他の成分によるもの なのかを特定できないという限界がある。

6. AAの有効性を最大化するための様々なアプローチ
AAは化学的に活性であり、水溶液中では不安定である。AAは酸素依存的または非依存的な方 法で容易に酸化または分解され、その反応速度は酸素濃度、温度、および金属イオン濃度とともに 増加する［3,39］。水溶液中におけるAAの分解速度はpHに依存し、pH 5.6ではpH1.0〜4.4やpH 6.8〜 8.4の場合よりも速く分解する［78］〇水-油エマルジョン中のAAの半減期は、25。Cで20日、45。Cで10 日と推定されている［79］〇 AAは光酸化を受けやすい［80］〇

AAは親水性の化合物であり、皮膚からの吸収は限定的である。無毛マウスの切除皮膚を 用いた実験では、角質層を除去した皮膚におけるAAの透過率は、角質層が残っている皮膚と比較 して約10倍に増加したことから、AAの皮膚吸収における主な障壁は角質層であることが示され た［81］〇
化粧品は、好気性かつ保湿された環境下で比較的長期間にわたって継続的に使用されるため、 有効成分の有効性や安全性に加え、その化学的安定性も重要となる。さらに、化粧品は皮膚に局所 的に塗布されるため、有効成分が皮膚から効果的に吸収されることも重要である。この観点から、 AAはコスメシューティカルとして欠点のある素材である［30］〇
AAのコスメシューティカルとしての欠点を克服し、その臨床的有効性を最大化するために、 様々なアプローチが開発されており、その一部を図1に示す。

6.1.利点を付加したAA誘導体
優れた安全性、生物活性、および安定性を備えた様々なAA誘導体が開発されている［82］〇図2には、 AA (1)およびその誘導体の一部について、化学構造が示されている。
疎水性のアスコルビン酸前駆体は、単純拡散によって細胞膜を通過して細胞内に取り込まれ、 細胞内で酵素的に加水分解されてアスコルビン酸を再生することができます。例えば、ヒト皮膚線 維芽細胞(TIG118)において、外部から添加したアスコルビル6•〇ーパルミテート2ーリン酸(三ナト リウム塩)(2)は、外部から添加したAAよりも効果的に細胞内のAA濃度を上昇させた(4.1倍対2.3倍 )［83］〇 外部からのAAによる細胞内AAの増加は、それぞれSVCTおよびGLUTの阻害剤である 12-ミリスチン酸13-アセテートおよびグルコースによって阻害されたが、アスコルビル6-0-パルミ テート2-リン酸による増加は影響を受けなかったことから、これは単純拡散によって吸収されるこ とが示唆される。アスコルビル6-0•パルミテート2-リン酸は、主にアスコルビル6-0•パルミテート (3)および一部はアスコルビル2・リン酸(4)を通じて、細胞内酵素によってAAに変換された。
我々の研究［84］では、メラニン合成を抑制し、コラーゲン合成を促進する多機能コスメシューテ イカル剤として、アスコルビル3・〇・クマラート(5)およびアスコルビル2・〇・クマラート(6)を合 成した。100pMでは、アスコルビル3・0・クマラートおよびアスコルビル2・0・クマラートは、ヒト真皮メラノ サイトのメラニン含有量をそれぞれ65%および59%減少させた。100〜300|iMの濃度では、これらの化合物 はヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成を、それぞれ120〜144%および125〜191%増加させた。 これらはI型プロコラーゲンのC・ペプチド放出を増加させ、アスコルビル2・〇・クマラートはMMP1 レベルを低下させたことから、これらは複数のメカニズムによってコラーゲン代謝を調節している 可能性がある。
3・〇・エチルアスコルビン酸(7)はアスコルビン酸の安定化形態であり、グリセロール、プロピ レングリコール、1,2・ヘキサンジオールなどの適切な単一溶媒を使用することで、皮膚への浸透性を 高めることができる［85］〇 3・〇・エチルアスコルビン酸(30%)、乳酸(1%)、およびその他の成分を 含む美容液について、HaCaTケラチノサイト、ヒト真皮線維芽細胞、再構築ヒト表皮、および再構築 ヒト色素表皮において、安全性および生物学的活性が試験されている［86］〇この血清は、紫外線(UV) BによるDNA損傷とメラニン合成を抑制し、コラーゲン産生を増加させた。
Multiple phase emulsions, Anhydrous vesicles, Nanoparticles, Liposomes, Spanlastic vesicles, Gels, Aptamers, Polyols



Epidermis

Derma! fibroblasts
図1•皮膚のコラーゲンを増強するアスコルビン酸(AA)の有効性を局めるための様々な戦略。AAは中性pH下ではアスコル ビン酸イオン(Asc-)として存在する。AAの有効性は、他のビタミン、アミノ酸、ペプチド、成長因子、天然物 などの有効成分と配合することで、相乗的に高められる可能性がある。AAを多相エマルジョン、無水ベシクル 、ナノ粒子、リポソーム、スパンラスティックベシクル、ゲルに配合することで、AAの安定性と皮膚透過性が向 上する。アプタマーやポリオールは、AAの安定化に寄与する。AAの皮膚浸透性を高めるため、その局所塗布を、 イオントフォレーシス、レーザー皮膚再生、メソセラピー、振動マイクロニードルや光音響波の使用といった 他の処置と組み合わせることができる。AAを充填した溶解性マイクロニードルパッチも、この目的のために有用 である。化粧品における安定性を高め、皮膚細胞へのAAの供給をより効果的に行うために、AAの代わりにAAグリ コシドや疎水性AA前駆体を使用することができる。AAグリコシド(AA-G)は、皮膚を通過する際に酵素的に加 水分解され、AAを放出する。AAがSVCTファミリーを介して細胞内に入るのに対し、疎水性AA前駆体(AA-R )は単純拡散によって細胞内に入り、細胞内酵素によってAAに変換される。コラーゲン生成の過程において、AA は転写段階においてプロコラーゲン遺伝子のmRNA発現を刺激します。また、AAは2ーオキソグルタル酸依存性ジ オキシゲナーゼ(Enz)の補因子として作用することで、翻訳後修飾段階におけるプロコラーゲンのヒドロキシ ル化を促進します。AAは、酵素の活性部位にある鉄イオンを還元しながら、デヒドロアスコルビン酸(DHA )に酸化されます。DHAは、グルタチオン(GSH)がグルタチオンジスルフィド(GSSG)に酸化される反応と連動し て、酵素によってAAに還元されます。GSSGは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸水素( NADPH)がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)へと酸化される反応と連鎖して、GSHへと 還元される。アミノ酸は、翻訳段階で必要とされるタンパク質の構成要素として機能する。特に、グリシン、プロ リン、リジン、またはそれらの前駆体は、コラーゲンの生成を促進するのに役立つ。



図2•アスコルビン酸およびその誘導体の化学構造。


















28種類のアルキルグリセリルAA誘導体を合成し、テオフィリン刺激を受けたB16メラノ ーマ4A5細胞 を用いて、それらがメラニン生成を阻害するかどうかを調べた［82］〇アルキル鎖が長くなるほどメラニン 生成阻害効果は強まったが、細胞毒性も増加した。3•〇-(2,3•ジヒドロキシプロピル)-2.〇・ヘキシルアスコ ルビン酸(8)および2-〇-(2,3-ジヒドロキシプロピル)-3-0•ヘキシルアスコルビン酸(9)は、その阻 害活性と低毒性から最適化された化合物として選定された。両化合物はアスコルビン酸(AA)より も安定性が高かった。
AAは、皮膚の天然脂質であるスクアレンと結合させ、AA-スクアレン複合体(10)の生物学的 活性をヒト皮膚組織片を用いてex vivoで検討した［87］〇 AA-スクアレン複合体(3%)は、10日間の 塗布後、遊離AAやアスコルビル6-0-パルミテートよりも高い程度で、表皮の厚さおよびコラーゲン IIIとグリコサミノグリカンの発現を有意に増加させた。また、遊離AAやアスコルビルパルミテート 、さらには陰性対照と比較して、表皮および真皮における様々なECM成分の転写を増加させた。
液状のAA前駆体であるアスコルビルテトライソパルミテート(11)は、ヒトケラチノサイトに おいてUV-Aによる細胞毒性を抑制し、コラーゲン産生を促進し、ヒト線維芽細胞においてMMP2お よびMMP9の活性を抑制した［88］〇 その抗しわ効果は、23名の女性被験者を3つのグループに分け、 顔の片側の眼周囲に1%、2%、または3%のアスコルビルテトライソパルミテートクリームを、もう 片側にプラセボクリームを8週間塗布する、二重盲検、無作為化、プラセボ対照、スプリットフェイ ス臨床試験で評価された［89］。各アスコルビルテトライソパルミテートクリームは、用量依存性は認めら れなかったものの、プラセボと比較して眼周囲のしわを有意に減少させた。
アスコルビル2-0-グルコシド(12)は、ヒト真皮線維芽細胞においてコラーゲン合成を促進し、抗 酸化作用および抗老化作用を示す［90,91］〇この化合物は、肌のアンチエイジングなど、さまざまな目的で 化粧品に使用されている［92］〇この化合物は親水性が強いため、その皮膚透過性はAAよりも低い［93］ 〇この化合物は化粧品製剤中で比較的安定しており、局所的に塗布されると皮膚内で酵素的に加水 分解され、AAを生成する［93,94］〇
要約すると、特定の疎水性AA前駆体は、細胞膜を容易に通過できるため、細胞質内のAA濃度を 高めるという点で、AA自体よりも効果的である可能性がある［83,88］〇局所的に塗布されたAA配糖体は 、皮膚内で酵素加水分解によりAAを継続的に放出するため、AAの貯蔵庫として機能し得る［94］。生物 学的活性や物理化学的性質の異なる2つの物質を共有結合させることによって開発された多機能ハイ ブリッド化合物は、さらなる利点をもたらすだろう［84,87］〇
6.2. AAの安定性と皮膚吸収性を向上させる製剤
薬剤の安定性を高め、徐放性を向上させるため、AAの多相エマルジョンが調製された［95］〇 2 段階のプロセスにより、非イオン性シリコン化界面活性剤、ソルビタン誘導体、およびポリグリセロ ール誘導体などの共界面活性剤を用いて調製した油/水/油エマルジョンは、おそらく界面活性剤の親 水性頭部によって囲まれた逆ミセル内にAAを封入することで、AAの安定性を大幅に高めた。 フラン ツ拡散セルを用いたin vitro放出試験では、多相エマルジョンから最初の4時間でAAの約14%が放 出され、その放出プロファイルは〇次反応速度論に従うことが示された。
水性基剤よりも高い安定性を確保するため、無水油/ワックス基剤または無水シリコーン/油 /ワックス基剤中にAAの微細粒子を含有する無水製剤が調製された［96］。切除直後の人間の腹部皮膚に 局所的に塗布したこの無水製剤は、48時間以内にI型およびIII型コラーゲンならびにサイトケラチン の産生を増加させた。
アプタマーは、幅広い分子に対して特異的な結合親和性を示す、一本鎖のDNAまたはRNAを基盤と するオリゴヌクレオチドである［97］〇 AAと最適化されたDNAアプタマーとの複合体形成により、その 安定性が向上した［98］〇この複合体は、in vitroにおけるヒト真皮線維芽細胞においてMMP!の発現を 抑制し、コラーゲン合成を促進したほか、女性被験者22名を対象に8週間実施された臨床試験におい て、目尻のしわを改善した。
化粧品に使用される一部のポリオールは、アセチルアセチレン(AA)の半減期を延長するこ とができ、グリセリンを添加することで、プロピレングリコールを添加する場合よりも、水ー油エマル ジョン中のAAの安定性がより効果的に向上した［79］〇ポリアクリル酸とグリセロールを主成分とするゲ ル製剤では、単一成分溶液と比較して、AAの光酸化が著しく遅かった［99］。
AAおよびその誘導体を効率的かつ制御された形で送達するために、さまざまな種類のナノ粒子が 開発されてきた［100,101］〇 Stevanovicらは、共重合体ポリ(D, L・ラクチドーco・グリコライド)(DLPLG )ナノ粒子を製造し、ナノ粒子の球形、サイズ、および均一性を維持しながら、水相と有機相の均 質化を通じて、ポリマーマトリックスに最大15%のAAを封入した［100］〇 Duarahらは、溶媒蒸発 法を用いてAAをエチルセルロースナノ粒子に担持し、ヒドロキシプロピルメチルセルロースゲルと 配合した［101］〇最適化されたゲルは、in vitroで8時間にわたるAAの持続放出を示した。
ホスファチジルコリンリポソーム製剤は、ヒト患者の腹部皮膚におけるアスコルビン酸ナトリウム のex viv 〇浸透性を高めた［102］〇 アスコルビン酸ナトリウムを封入したホスファチジルコリンリポソー ムは、表皮よりも真皮への拡散性が優れている。このリポソームは、UV-A/UV-B放射線に曝露され たヒト皮膚において、抗酸化作用および抗炎症作用を示した。負に帯電したリポソームへのAAの封 入は、AAの安定性、皮膚透過性、および細胞吸収性を高め、AA溶液よりも高いコラーゲン合成促進 効果を示した［25］〇切除したブタの耳の皮膚を通るAAの透過量はリポソームの組成に影響を受け、 コレステロールの存在と表面電荷が皮膚を通過するAA量の増加に寄与した。この製剤は、遊離AA溶 液と比較して薬物透過量を7倍に増加させた。
Starrらは、水溶液または超分子ハイドロゲル製剤中のAAおよびアスコルビル2.〇ーグルコシドの 3次元皮膚透過プロファイルをex vivoで解析した
飛行時間型二次イオン質量分析法(ToF-SIMS)を用いてブタの組織を分析した［93］〇その結果、 AAおよびアスコルビル2.〇・グルコシドは、両親媒性ジェミニイミダゾリウム系界面活性剤を含 む超分子ハイドロゲルの形態で塗布した場合、皮膚への吸収が大幅に増強されることが示され た。アスコルビル2-0.グルコシドの皮膚吸収率はAAよりも低かったが、前者が皮膚組織内で後 者を放出することが確認され、アスコルビル2-0-グルコシドがAAを長時間持続的に供給する上で 有用であることが裏付けられた。
3-0-エチルーL-アスコルビン酸の局所送達を目的として、Iliopoulosらによって二元および三元溶媒系が 開発されている［103］〇プロピレングリコールとプロピレングリコールモノラウレートの二成分混合 物は、個々の溶媒と比較して、ブタの皮膚を通じた3•〇-エチルアスコルビン酸の皮膚透過性を効 果的に高めた。プロピレングリコール:プロピレングリコールモノラウレート:イソプロピルミ リスチネートを含む最適化された三成分溶媒系は、3•〇ーエチルアスコルビン酸の皮膚送達率を最大 70.9%まで向上させた。
Span 60とTween60の最適化された比率(5 :1)を用いて調製したAA含有スパンラスティック 小胞は、高い封入効率、安定性の向上、良好な物理化学的安定性、および角質層への薬物浸透性の 改善を示した［104］〇 AAを負荷したスパンラスティック小胞の局所塗布は、UV-B放射線に曝露され たラットにおいて、AA溶液と比較してより効果的に皮膚内のMMP2およびMMP9の発現を抑制し、 表皮の厚さを正常化し、真皮のコラーゲン線維の緻密な配列を正常化した。
要約すると、AAの化粧品への応用における最大の課題は、安定性を維持し、標的部位への送 達性を向上させることであり、これは様々な先進的な製剤技術によって部分的に克服されている。 実際、これらの技術は化粧品に応用されつつある［105］〇 AAの産業的応用を拡大するためには、最適 な製剤に関する継続的な研究開発が必要である。
6.3. AAの皮膚吸収を高めるための医療機器の活用
AAの経皮吸収を高めるために、局所塗布をイオントフォレーシスやレーザー皮膚再生などの 他の処置と組み合わせることができる。
Ebiharaらは、放射性［14C］-AAを用いて、ラットの皮膚におけるイオントフォレーシスによる薬 物吸収を追跡した
［106］〇 AAの局所塗布後にイオントフォレーシスを併用すると、単純な局所塗布と比較して経皮薬物 吸収が著しく増強された。真皮内の放射性トレーサー濃度は、塗布後1時間で最大値に達した。Hori らは、ヒドロキシプロリン濃度を指標として、イオントフォレーシスがラットの皮膚におけるコラ ーゲン産生を増加させることを実証した［107］〇コラーゲン産生は、イオントフォレーシスの持続時 間および電気刺激のパルス形態によって影響を受けた。皮膚のコラーゲン含有量を増加させるとい う点では、頻繁に極性を反転させる双極電気刺激が、連続的な単極パルス電気刺激よりも効果的で あった。
レーザーによる皮膚の前処理は、3-0-エチルアスコルビン酸やアスコルビン酸2-0-グルコシド などのAA誘導体の経皮送達を促進することが示された［108］〇雌のBalbヌードマウスの皮膚の角質層 をエルビウム:YAGレーザー治療によって部分的に切除したところ、3-0-エチルアスコルビン酸お よびアスコルビン酸2-0ーグルコシドの透過量は、無処理の皮膚の場合と比較して、それぞれ105〜 189倍、35〜78倍高くなった。皮膚をC〇2レーザーで治療した場合、3•〇ーエチルアスコルビン酸およ びアスコルビン酸2-0ーグルコシドのフラックスは、無傷の皮膚を通過するフラックスと比較して、それ ぞれ181〜277倍、82〜117倍高くなりました。
振動マイクロニードルを用いて、1.5%のAAゲルが塗布された［109］〇振動マイクロニードルは 、振動強度、照射出力、およびAAゲルの塗布時間に依存して、ラットの切除された腹部皮膚を通じ たAAの浸透を促進した［109］〇皮膚の下の中胚葉層に、一連の穏やかな微細注射を行う低侵襲の手 法であるメソセラピーも、追加の選択肢となり得る［110,111］〇
ピエゾフォトニック(光圧変換)トランスデューサーに吸収されたレーザーパルスによって生 成される光音響波は、皮膚バリアを損乱し、アスコルビル2-0ーグルコシドの皮膚への送達を促進するた めに用いられてきた［112］〇光音響波への5分間の曝露を組み合わせた
2%アスコルビル2-0ーグルコシドゲルを使用することで、製剤を皮膚に1時間接触させた場合の受動的 送達と比較して、厚さ760 gmのブタ皮サンプルを通じた薬物送達効率が15倍に向上した。
したがって、医療機器や処置を利用することは、単一成分または多成分製剤中のアスコルビン酸( AA)またはその誘導体の皮膚吸収を高めるという利点がある。しかし、医療機器や処置が高価であっ たり、使用に技術的スキルを要したりする場合、一般の消費者や患者が利用できる機会は限られて しまう。さらに、電子機器や機械装置の使用により副作用が生じるリスクがあるため、注意が必要 である。
6.4. AAの抗酸化作用および他の抗酸化物質との併用
内的要因と外的要因が相互作用する過程において、皮膚は加齢に伴う様々な機能的・構造的変性 を経験する［18］〇皮膚の老化を遅らせたり緩和したりするためには、細胞の栄養、エネルギー、およ び酸化還元バランスを最適な状態に維持しなければならない［113］〇この目的のため、AAなどの抗酸 化物質を外部から供給することは、有望なアンチエイジング戦略の一つである［29］〇120mJcm-2の 紫外線照射前または照射後に、再構成ヒト表皮にAA (100および500 mM)を処理すると、細胞死、 アポトーシス、活性酸素種(ROS)の生成、および腫瘍壊死因子ーαの発現が抑制された［114］〇
抗酸化物質として、AAは直接的または間接的にコラーゲンの分解を抑制することができる。MMPは、 コラーゲンやその他のECM成分の分解に関与する亜鉛含有エンドペプチダーゼである［15,16］〇加齢 した皮膚ではMMPの活性が増加する［23,24,66］。活性酸素種(ROS)はアクチベータータンパク質ー1( AP-1)および核因子-KB (NF-KB)を刺激し、これらがさらに、紫外線(UV)や粒子状物質などの環境 要因に曝露された表皮ケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞におけるMMPの発現を促進する［19,115- 117］〇 AAは、ヒト真皮線維芽細胞において、UV-Aによって誘導されるMMP!および2の発現［118］、あるいは UV-Aと粒子状物質の組み合わせによって誘導されるMMP!およびMMP9の発現を抑制することが示された ［119］〇 AAによるMMPの発現抑制効果は、その抗酸化作用および抗炎症作用と関連していると考えられてい る［120］〇 AAの抗酸化作用は、α-トコフェロールなど、異なる酸化還元電位を持つ他の抗酸化物質と 組み合わせることで増強される［121,122］〇 AAを、作用機序の異なる他のビタミン、天然物、また はペプチドと組み合わせることで、光酸化ストレスから細胞を相乗的に保護し［123］、コラーゲン合 成を促進し［72-74］、皮膚の老化を遅らせることができる［71,75-77］〇 GSHおよびNADPHはAAの酵 素的再生における電子供与体として利用されるため、AAをチオール化合物やニコチンアミドと組み
合わせることで、AAの生物学的効果を高めることができる。その利用に関する研究 チオール化合物やニコチンアミドをコスメシューティカルとして活用する研究が活発に行われている ［113,124］〇
酸化還元電位、作用機序、由来が異なる様々な抗酸化物質が組み合わせて使用される理由は、 各抗酸化物質を単独で使用する場合よりも生物学的効果が向上すると期待されるためである ［125,126］〇これは論理的な推論ではあるが、多くの抗酸化物質は場合によってはプロオキシダント として作用し、細胞内の酸化ストレスを増大させる可能性があるため、実験的および臨床的に証明 されなければならない［127］〇さらに、化学的活性を持つ抗酸化物質を化粧品製剤に配合すると、製 品の安定性に影響を及ぼす可能性がある［128］〇複数の成分を併用することにはこうした利点と欠点 があるため、組み合わせる抗酸化物質の選定には慎重さが求められる。
6.5. コラーゲン産生を相乗的に増加させるためのん4とアミノ酸の組み合わせ
コラーゲンやエラスチンなどのECMタンパク質は特有のアミノ酸組成を持っため、細胞内でのその産 生は特定のアミノ酸の利用可能性に影響を受ける［129-132］〇コラーゲンタンパク質は三重らせん構 造をとっており、そのアミノ酸配列はグリシン-プロリン-x、あるいはグリシン-X-ヒドロキシプロリ ンの繰り返しからなり、ここでXは任意のアミノ酸である［10］〇グルタミンまたはグルタミン酸は、 ピロリン5ーカルボキシレートを介してプロリンの産生を増加させ、それによって細胞内のコラーゲン 産生を増加させる［133］〇外部からのプロリン補給は、特にグルタミン欠乏培地において、コラーゲ
ン産生を増加させる［134］〇
コラーゲンタンパク質のアミノ酸残基の3分の1をグリシン残基が占めていることから［10,13］、グリシン の供給はコラーゲン合成の制限因子となる可能性がある。Paz-Lugoらによる研究［135］では、関節軟 骨細胞において、外部からのグリシンがプロリン、リジン、その他のアミノ酸よりもコラーゲン産 生に対して強い効果を示すことが実証された。我々の研究［136］においても、ヒト真皮線維芽細胞に おいて、20種類の遊離アミノ酸の中でグリシンが最も効果的にコラーゲン産生を促進した。さらに 、20種類のアミド化アミノ酸の中ではグリシンアミドが最も効果的であった。驚くべき新たな知見 として、グリシンアミドはグリシンよりもはるかに効果的にコラーゲン産生を増加させることが明らかにな った。対照的に、N-アセチルグリシン、N-アセチルグリシンアミド、グリシンメチルエステル、グリ シンエチルエステル、グリシルグリシンなどの他のグリシン誘導体は、コラーゲン産生を増加させ なかった。したがって、グリシンアミドは、細胞内のコラーゲン産生を促進するためのグリシン前 駆体の最適化された形態であると考えられる。
AA (1mM)とグリシンアミド(1mM)の併用は、ヒト真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産 生を相乗的に促進し、TGF-pl (lOngmLT)で処理した細胞と同等のレベルまで高めた［136］〇アス コルビル-2-リン酸(マグネシウム塩)、3-0-エチルアスコルビン酸、アスコルビルテトライソパル ミテート、アスコルビル-2-0.グルコシドなどのAA誘導体は、コラーゲン産生を促進し、グリシンア ミドと併用すると相乗効果を示した。したがって、AA類似体(すなわち、AAおよびアスコルビル 2ーリン酸)とグリシン類似体(すなわち、グリシンおよびグリシンアミド)を組み合わせることで、コ ラーゲン合成を相乗的に改善することが可能である［136］〇
併用療法の特徴は、単一の化合物を高濃度で使用するのではなく、作用機序の異なる複数の化 合物を低濃度で組み合わせることで、同等またはそれ以上の臨床効果を達成することにある［137,138］ 〇細胞の微小環境の変化に応じて、転写段階または翻訳段階で細胞内のコラーゲン産生が促進され ることを考慮すると、異なる段階で作用する複数の化合物を組み合わせることで、細胞内のコラー ゲン産生を相乗的に増加させるという利点が期待される［21］〇また、各化合物を高濃度で使用した場 合に生じうる副作用のリスクを回避できるという利点もある［139］〇しかし、この併用療法の臨床的 有用性については、まだ確立されていない。
7.考察
皮膚の内因性老化および外因性老化はいずれも酸化ストレスによって媒介され、ECM成分の合 成減少および分解の増加を伴う。したがって、抗酸化物質および酵素補因子としてのAAの機能は、 皮膚の健康維持および皮膚老化の予防において極めて重要である［28,29］〇
いくつかの臨床試験の結果によると、AAおよびその前駆体は、光老化や皮膚の自然な老化の過 程におけるコラーゲンの減少を防ぐことで、しわを軽減し、皮膚の弾力性を高めることが示唆され ている［67-69,89］〇特に体内のAA濃度が正常値より著しく低い場合、AAの外部からの補給は有益な効果 をもたらす可能性がある［67］〇 AAの皮膚コラーゲン増強効果は、コラーゲンレベルが低い患者や、光 老化または自然老化による皮膚変化が見られる人々において、より顕著に現れる可能性がある［68］。 —方、体内に十分な量のAAが存在する場合、その補給は必要ない可能性があり、過剰な投与は健康 を害する恐れがある［140］〇したがって、皮膚のAAおよびコラーゲンレベルを事前に診断しておけば 、患者に合わせたAA製品を使用することで、最良の臨床効果が得られると期待される。
AAが機能的および構造的に成熟したコラーゲンの産生を促進する作用機序は、すでに確立されてい る［53-55］。AAは、プロコラーゲンのプロリンおよびリジン残基のヒドロキシル化を触媒する、プロ リル4-ヒドロキシラーゼ、プロリル3-ヒドロキシラーゼ、リシル5ーヒドロキシラーゼなどの2-オキ ソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼの補因子として作用する［5,43］〇 —方、薬理学的用量のAAがコ ラーゲン遺伝子の発現を誘導する作用は1980年代初頭に発見されたものの［57,58］、その詳細な分子メ カニズムについてはさらなる解明が待たれている。濃度によっては、AAは抗酸化物質としても酸化
促進物質としても機能し、細胞シグナル伝達過程に影響を与えることで、 制御する転写因子を直接活性化することができる。
伝達プロセスに影響を与えることで、コラーゲン遺伝子発現を制御する転写因子を直接活性化する ことができる。あるいは、AAはTGF-p!の発現を増加させ、関連するシグナル伝達プロセスを活性化 することで、最終的にコラーゲンの遺伝子発現を増加させる可能性もある。これらの可能性を検討 する包括的な研究が必要である。
コラーゲン産生過程において、アラニン(AA)は遺伝子転写段階および翻訳後修飾段階にお いて重要な役割を果たすが、翻訳段階には直接的な影響を与えない。一方、アミノ酸の供給は、タ ンパク質の構成要素を提供することで、翻訳段階に大きな影響を与える可能性がある。したがって 、コラーゲン産生過程の異なる段階で作用するアラニンとアミノ酸を組み合わせることで、相乗的 にコラーゲン産生を増加させることが可能である。ヒト真皮線維芽細胞を用いた我々の最近のin vitro研究は、この考えを完全に支持している[136]〇アミノ酸アナログ(AAやアスコルビル2.リン酸 など)とアミノ酸アナログ(グリシンやグリシンアミドなど)を併用して細胞内のコラーゲン産生 を促進する戦略は、肌のアンチエイジングに有用であると考えられる。この併用戦略の臨床的有用 性と有効性を検証するためには、さらなる研究が必要である。
8.結論
AAの化学的不安定性と皮膚吸収の難しさが、その医療および化粧品分野での応用を制限してき た。これらの問題を解決し、最高の有効性を得るために、様々な戦略が開発されている。AAおよび コラーゲン濃度が低い患者において、AAの真皮コラーゲン増強作用および皮膚のアンチエイジング 効果はより顕著である。AAの類似体とアミノ酸の類似体を組み合わせることは、アンチエイジング を目的とした皮膚コラーゲン産生を効果的に促進する新たな可能性を切り開くかもしれない。この 新しい戦略を検証するためには、さらなるin vivo試験および臨床研究が必要である。
資金提供:本研究は、韓国政府が資金を提供する韓国研究財団(NRF)の助成金(科学技術情報通信部)(No. 2019R1I1A2A01045132)、および大韓民国保健福祉部が資金提供し、韓国健康産業振興院(KHIDI)を通じて実施 された韓国健康技術研究開発プロジェクトからの助成金(No. HP20C0004)により支援されました。
利益相反:著者は利益相反がないことを宣言する。
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※原文

antioxidants
Review
Ascorbic Acid (Vitamin C) as a Cosmeceutical to Increase Dermal Collagen for Skin Antiaging Purposes: Emerging Combination Therapies
Yong Chool Boo 1,2,3O
1 Department of Molecular Medicine, School of Medicine, Kyungpook National University,
680 Gukchaebosang-ro, Jung-gu, Daegu 41944, Korea; ycboo@knu.ac.kr; Tel.: +82-5-3420-4946
2 BK21 Plus KNU Biomedical Convergence Program, Department of Biomedical Science, The Graduate School, Kyungpook National University, 680 Gukchaebosang-ro, Jung-gu, Daegu 41944, Korea
3 Cell and Matrix Research Institute, Kyungpook National University, 680 Gukchaebosang-ro, Jung-gu, Daegu 41944, Korea
Abstract: Ascorbic acid (AA) is an essential nutrient and has great potential as a cosmeceutical that protects the health and beauty of the skin. AA is expected to attenuate pho to aging and the natural aging of the skin by reducing oxidative stress caused by external and internal factors and by promoting collagen gene expression and maturation. In this review, the biochemical basis of AA associated with collagen metabolism and clinical evidence of AA in increasing dermal collagen and inhibiting skin aging were discussed. In addition, we reviewed emerging strategies that have been developed to overcome the shortcomings of AA as a cosmeceutical and achieve maximum efficacy Because extracellular matrix proteinsz such as collagenz have unique amino acid compositionsz their production in cells is influenced by the availability of specific amino acids. For example, glycine residues occupy 1/3 of amino acid residues in collagen protein, and the supply of glycine can be a limiting factor for collagen synthesis. Experiments showed that glycinamide was the most effective among the various amino acids and amidated amino acids in stimulating collagen production in human dermal fibroblasts. Thus, it is possible to synergistically improve collagen synthesis by combining AA analogs and amino acid analogs that act at different stages of the collagen production process. This combination therapy would be useful for skin antiaging that requires enhanced collagen production.
Keywords: ascorbic acid; vitamin C; collagen; skin aging; antiaging; amino acid; glycinamide; glycine; cosmetic; cosmeceutical
1. Introduction
L-Ascorbic acid (AA) (vitamin C), discovered during research into the causes and treatment of scurvy, plays an essential role in human physiology [1].The biochemical function of AA is mostly related to its redox activity [2,3]. In other words, AA has the characteristic of being easily oxidized by releasing electrons in an aqueous solution, so it can act as a water-soluble antioxidant that removes reactive oxygen species (ROS) or free radicals [4]. It also acts as a cofactor that assists catalytic activity by reducing metal ions in the active site of the enzyme [5,6]. AA also performs other essential functions for cell physiology and human health, such as preserving important biomolecules in a reduced state [7].
Collagen is the most abundant protein in our body and is a major component of the extracellular matrix (ECM) [8,9]. Collagen molecules exist in a triple helix structure in which three primary protein strands are twisted, and the amino acid sequence of the collagen protein is typically glycine-proline-X or glycine-X-hydroxyproline, where X may be any amino acid other than glycine, proline, or hydroxyproline [10,11].Twenty-eight types of collagen proteins are known so farz and there are some differences in amino acid composition and sequence [12,13]. Transforming growth factor (TGF)-pl plays an important and diverse role in the synthesis of collagen [14], and the degradation of collagen is mediated by matrix metalloproteinases (MMPs)[15,16].
The skin is an organ that is exposed to various external environmental factors [17]. In the process of interaction of internal and external factors, the skin undergoes various types of functional and structural degeneration associated with aging [18]. Skin collagen is composed of 80-90% type I, 8-12% type III, and 5% type V [19]. Insufficient collagen synthesis and maturation due to genetic factors or nutritional deficiencies, and excessive increase in collagen synthesis due to an autoimmune response, can cause skin diseases [20]. Extrinsic and intrinsic skin aging commonly leads to changes in the amount, type, and structure of collagen [21,22], which is accompanied by a decrease in TGF-pl and an increase in MMPs [23,24].
AA is known to affect multiple stages in collagen production. As an essential cofactor of prolyl hydroxylase and lysyl hydroxylase, AA plays a critical role in the maturation of collagen at the post-translational stage [25]. AA has been observed to stimulate procollagen I and III gene transcription in cells [26,27]. The level of AA in the skin cells is closely associ¬ated with the quantitative and structural integrity of dermal collagen, and AA deficiency causes skin aging [28,29]. Thus, the external supplementation of AA is one of the attractive strategies for skin antiaging [29]. On the other hand, AA has limitations in that it is easily oxidized and difficult to absorb into the skin [30].
The purpose of this review is to examine the potential and applications of AA as a cosmeceutical active ingredient to promote collagen production for skin antiaging pur¬poses. First, we will briefly discuss the biochemical basis of AA associated with collagen metabolism. Then, we will review the evidence for dermal collagen-enhancing and skin antiaging effects of AA. Finally; we will introduce emerging approaches to overcome the shortcomings of AA and maximize its clinical efficacy. It is hoped that this review will help to derive future tasks necessary for the development of advanced skin antiaging strategies.
2. Biochemical Properties of AA
AA is synthesized through multiple pathways in plants and some animals [31,32]. However, humans cannot make AA because they lack functional gulonolactone oxidase catalyzing the last step of AA synthesis [33]. So AA is a kind of vitamin to humans that must be ingested from the outside. Externally sourced AA and its oxidized form, dehydroascorbate (DHA), can enter cells through specific mechanisms of transport [34]. The sodium-dependent vitamin C transporter (SVCT)1 and SVCT 2 of the human solute carrier (SEC) 23 family mediate the active transport of AA [35]. The facilitated transport of DHA is mediated by GLUT 1,GLUT 3, and GLUT 4 of the glucose transport (GLUT) family [36]. The hydrolysis of DHA yields 2,3-diketo-L-gulonate, which is further hydrolyzed to oxalate and L-erythrulose, decarboxylated to form L-xylonic acid or L-lyxonic acid, or degraded to other small molecules [32].
AA is a type of diacid and is present in the form of ascorbate mono-anion (Asc-) in a neutral aqueous solution [37]. Oxidation reactions of AA produce monodehydroascorbate (ascorbyl radical, Asc*) and DHA. AA is easily oxidized by reaction with oxygen at high temperatures [38] and the reaction is facilitated by transition metal ions [39]. AA rapidly reacts with various types of ROS and free radicals to scavenge them, and it is oxidized to ascorbyl radical[3]. The reaction of AA with singlet oxygen produces DHA and hydrogen peroxide [40]. By scavenging the lipid radicals mediating the chain reaction of lipid peroxidation in the cell membrane, <x-tocopherol acts as a chain-breaking antioxidant [41]. The generated(x-tocopheroxyl radical reacts with AA to regenerate(x-tocopherol, and, as a result, AA is oxidized to ascorbyl radical.
AA functions as an essential cofactor of certain metalloenzymes, such as 2-oxoglutarate- dependent dioxygenases [5]. 2-Oxoglutarate-dependent dioxygenases have iron ions at their active sites, and the reaction requires molecular oxygen and 2-oxoglutarate (also called oc-ketoglutarate) as co-substrates [42]. The enzymes play an important role in collagen metabolism and many other biochemical processes, such as development, transcriptional regulation, and the modifications of nucleic acid, hormones, fatty acids, and antibiotics [43]. In the catalytic process of the enzymes, by returning the oxidized iron ion to the reduced state, AA affects the activity of the enzyme and various physiological processes. Of course, in the course of this reaction, AA is oxidized.
AA can be regenerated from ascorbyl radical and DHA chemically and enzymatically. Two molecules of ascorbyl radical are disproportionated to form DHA and AA. Ascor¬byl radical can be directly reduced to AA by the enzymes with monodehydroascorbate reductase activity using half equivalent of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) + H+ [44]. DHA can be reduced to AA by the enzymes with dehydroascorbate re¬ductase activity in the concert of the oxidation of glutathione (GSH) to glutathione disulfide (GSSG) [45].
3. AA in Collagen Metabolism
Collagen is synthesized in cells and secreted to the outside through several complex steps [46]. In an early step, collagen genes are transcribed into mRNA in the nucleus, which is transported to the cytoplasm and translated by ribosomes to synthesize a pre-procollagen molecule [47]. The pre-procollagen is transported to the endoplasmic reticulum where the N-terminal signal peptide is removed, proline and lysine residues are hydroxylated, and specific hydroxyl groups of lysine residues are glycosylated by galactose and glucose [48]. Three procollagen molecules are left-twisted into a triple helix by zipper-like folds and transported to the Golgi apparatus [49]. After additional modifications in the Golgi ap¬paratus, the triple helix of procollagen molecules is assembled into secretory vesicles and transported out of the cell[50]. Both ends of the triple helix are removed to gener¬ate a tropocollagen molecule, and covalent bonds are formed between the tropocollagen molecules, producing collagen fibrils which are further bundled into collagen fibers [51].
As one of the posttranslational modifications of the protein, several amino acid residues such as proline, lysine, asparagine, aspartate, and histidine are hydroxylated [52]. In the case of collagen, the content of proline and lysine is particularly high, and the hydroxylation of these amino acid residues is important for stabilizing the structure of collagen proteins. The hydroxylation of proline residues occurs mainly at the y-C atom and sometimes at the p-C atom, and hydroxylation of the lysine residue occurs at the 6-C atom [53,54]. These reactions are catalyzed by enzymes called prolyl 4-hydroxylase, prolyl 3-hydroxylase, and lysyl 5-hydroxylase, respectively [55]. These 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases require AA for proper function, and thus AA deficiency can cause defects in collagen maturation [56].
In early studies, it was observed that AA enhances the production of collagen at pharmaco-logical doses, but its mechanism of action and physiological significance are controversial. AA was shown to selectively increase collagen protein synthesis without increasing noncollagenous protein synthesis in cultured human dermal fibroblasts [57,58]. The effect was associated with elevated mRNA levels of type I and type III procollagen [26,59]. Pinnel et al. [59] proposed a hypothesis that procollagen accumulated in the cell inhibits the translation of procollagen synthesis, and that AA releases the translational inhibition by promoting the hydroxylation and secretion of procollagen, which results in increased collagen gene transcription.
Other research groups have proposed that lipid peroxidation mediates the increase in collagen gene expression stimulated by AA [60,61].The addition of malondialdehyde, a product of lipid peroxidation, increased collagen gene expression, and oc-tocopherol, a chain-breaking antioxidant, inhibited collagen gene expression [60,61].However, cell- impermeable iron chelators, such as desferrioxamine and ethylenediaminetetraacetic acid, did not reduce AA-induced collagen synthesis although they abolished AA-mediated lipid peroxidation [62]. Thus, it is uncertain whether the antioxidant or prooxidant properties of AA are associated with its stimulatory action in collagen gene expression.
It would be interesting to examine whether the AA-induced collagen gene expression is associated with the modulation of 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases. If so, many target proteins of 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases, such as hypoxia-inducible fac¬tors (HIFs), could be considered potential regulators of collagen gene expression [52,63]. Separately; it is worth examining whether AA activates the specific protein 1(Spl) family; as these transcription factors are known as positive regulators of collagen gene expres¬sion [64,65]. Identification of the molecular mechanism underlying AA-induced collagen gene expression will contribute to the development of new strategies to enhance colla¬gen production.
4. Clinical Evidence for Dermal Collagen-Enhancing and Skin Antiaging Effects of AA
Do photoaging and the natural aging of the skin accompany changes in AA levels in the skin? Rhie et al. [66] reported the changes in the levels of antioxidant enzymes and antioxidants in the epidermis and dermis of sun-exposed forearms and sun-protected upper-inner arms in young (average 21.0 years old) and old (average 76.1 years old) Koreans. The epidermal and dermal AA levels of the photoaged skin were 69% and 63% of the levels of young skin, respectively; and the epidermal and dermal AA levels of the naturally aged skin were 61% and 70% of the levels of young skin, respectively. Thus, it is suggested that both photoaging and natural aging can lower AA levels in the epidermis and dermis, and external supplementation might help retard skin aging.
Clinical trials have been conducted on whether the topical application of AA can increase skin collagen. In a single-blind, randomized, split-face, placebo-controlled clinical study,10 postmenopausal women applied on the dorsal side of the upper forearm, a stabilized W/O emulsion cream containing 5% AA on one side and placebo on the other side, at night, once daily for 6 months [67]. The mRNA levels of collagen type I and type III in the skin biopsy were increased in AA-treated groups by 25% and 21%, respectively. However, in this study, no significant difference was observed between the AA-treated group and the control group in the concentration of collagen extractable from the skin.
In another clinical trial,5% AA cream and one of several cosmeceuticals were applied twice a day to the extensor surface of one forearm for 2 weeks, and the level of procollagen I in the skin biopsy was analyzed [68]. Statistical analysis of all19 subjects who applied 5% AA cream did not show a significant increase in procollagen level compared to the baseline before treatment. However, when the subjects were divided into a group with a low baseline procollagen I level(n = 9) and a group with a high baseline procollagen I level (n 二10), the former group showed a significant increase in procollagen I level with AA cream application. These studies suggest that AA helps to increase collagen in the skin, especially or only when there is a lack of AA or collagen.
Clinical evidence has been reported that topical treatment of AA alleviates the symp¬toms of skin aging. In a randomized, double-blind, placebo-controlled study enrolling 19 healthy female volunteers, topical application of 5% AA cream on the sun-exposed upper chest and forearm once a day for 6 months significantly increased the density of skin microrelief, decreased the deep furrows, and improved ultrastructure of the skin, compared to the excipient treatment [68]. In a split-face study enrolling 20 women subjects with photo-aged skin, topical treatment of 23.8% AA serum with iontophoresis on one side of the face once a day for 2 weeks improved hyperpigmentation, surface roughness, and fine lines on the treated side significantly compared to the other side spared for participants7 self-control[69].
The antiwrinkle effect of an AA-loaded dissolving microneedle patch was evaluated in a double-blind, split-face, placebo-controlled clinical study by applying it around crow's feet on one side of the face and a placebo patch on the other side, for 12 weeks in 23 subjects with notable wrinkles near the eyes [70]. The AA-loaded dissolving microneedle patch significantly reduced wrinkles in the crow's feet area without causing skin irritation and sensitization problems.
In a double-blind, prospective, randomized clinical trial, patients were subjected to the laser skin resurfacing procedure followed by topical treatment of 200 mg AA with or without a cosmeceutical containing growth factors [71].Three months after the treatments, there was a significant reduction in skin roughness and the average depth of periorbital wrinkles in both groups, and the group (n = 75) treated with AA plus growth factors showed better results compared with the group (n = 74) treated with AA alone.
The results of these studies suggest that cosmetic application of AA can help alleviate the symptoms of skin aging, but the number of studies is not considered sufficient to confirm it.
5. Clinical Studies Using a Combined Composition of AA and Other Active Ingredients
In cosmetics, many attempts are made to enhance efficacy by combining several active ingredients. We would like to introduce clinical trials that have evaluated the collagen enhancement and skin anti-aging effects of a combined composition of AA and other active ingredients.
In a double-blind placebo-controlled randomized study involving 159 volunteers, increased deposition of collagen fibers in the dermis and reduction in the depth of facial wrinkles were demonstrated in post-menopausal women who consumed a drink containing soy isoflavones, lycopene, AAZ and oc-tocopherol with a capsule containing fish oil, daily for 14 weeks [72].
A solution containing AA (5%), proteoglycans (3%), Rosa moschata oil (0.3%), polysor¬bate 80 (1%), propylene glycol (70%), water, perfume, and preservatives (sodium methyl¬paraben, sodium ethylparaben, and sodium propylparaben; 0.14%), was applied on the face every evening for 60 days in a clinical study involving 60 Caucasian female healthy indi¬viduals [73]. The ultrasonographic image analysis showed that the treatment significantly increased the high echogenic pixels that are associated with collagen levels.
In an ex vivo experiment using abdominal skin samples obtained from healthy women, topical application (2 mg cm-2) of a serum containing AA, ergothioneine, a proteoglycan- stimulating peptide (tetradecyl aminobutyroyl valylaminobutyric urea trifluoroacetate), soluble proteoglycans, and low molecular weight hyaluronic acid for 10 days significantly prevented the decreases in the levels of collagen, elastin, and proteoglycan induced by daily irradiation with UV/visible/infrared rays (10 J cm-2) or by daily treatment with hydrocortisone (10 略 mL-1)[74].
A split-face, randomized controlled trial involving 50 female volunteers demonstrated the skin antiaging effects (improvement in skin color, elasticity, radiance, smoothness, scales, and wrinkles) of an encapsulated serum that contains AA (20%), <x-tocophero 1,and Rubus idaeus leaf cell culture extract, which was topically applied on one side of the face for 2 months [75].
In an open-label study, application of a serum comprising AA (15%), oc-tocopheryl acetate, palmitoyl tripeptide-38 (5 ppm), and other ingredients to the face once daily for 56 days decreased skin roughness by 8% and improved skin tone (redness, 9% decrease; homogeneity, 8% increase) [76].
A formulation containing AA (10%), biopeptides (rice and lupin), hyaluronic acid, and Vichy volcanic mineralizing water with no preservatives, was tested in three consecutive clinical studies and shown to enhance skin cell turnover compared to untreated skin (cumulative fluorescence score of dansyl chloride probe, 59.6 versus 64.9) (for 3 weeks in 32 subjects); reduce the clinical grades of wrinkles at crow's feet, forehead, and nasolabial fold by 9%,11%, and 5.2%, respectively (for 4 weeks in 40 subjects); and decrease the number of crow's-foot wrinkles by 11.5% and their maximal vertical distance between the highest peak and lowest valley by 13% (after 29 days compared to the baseline in 52 subjects) [77].
These clinical results suggest that several combination compositions containing AA may help increase collagen in the skin and delay skin aging. Since the tested compositions contained multiple active ingredients including AA, there is a limitation in that it cannot be confirmed whether the efficacy is due to AA or other ingredients.
6. Various Approaches to Maximize the Efficacy of AA
AA is chemically active and unstable in aqueous media. It is easily oxidized or decomposed in an oxygen-dependent or -independent manner, and the reaction rate increases with oxygen concentration, temperature, and metal ion concentration [3,39]. The decomposition rate of AA is pH-dependent in an aqueous solution and AA is decomposed faster at pH 5.6 than at pH 1.0-4.4 or pH 6.8-8.4 [78]. The half-lives of AA in water-in-oil emulsions were estimated to be 20 days and 10 days at 25 °C and 45 °C, respectively [79]. AA is very prone to photooxidation [80].
AA is a hydrophilic compound and has limited skin absorption. In an experiment using excised hairless mouse skin, the permeation rate of AA through the skin with the stratum corneum removed increased about 10 times compared to that of the intact skin, so the main barrier to skin absorption of AA is the stratum corneum [81].
Because cosmetics are continuously used for a relatively long period under aerobic and moisturized conditions, the chemical stability of active ingredients is important in addition to their efficacy and safety. Furthermore, since cosmetics are applied topically to the skin, effective absorption of active ingredients through the skin is also important. From this point of view, AA is a material with shortcomings as a cosmeceutical[30].
Various approaches are being developed to overcome the shortcomings of AA as a cosmeceutical and to maximize its clinical efficacy, and some of them are illustrated in Figure 1.
6.1. AA Derivatives with Added Advantages
Various AA derivatives with excellent safety, biological activity, and stability have been developed [82]. In Figure 2, the chemical structure of AA (1)and some of its derivatives are shown.
Hydrophobic AA precursors can pass through the cell membrane and enter the cell by simple diffusion and can be enzymatically hydrolyzed in the cell to regenerate AA. For example, externally added ascorbyl 6-O-palmitate 2-phosphate (trisodium salt) (2) increased intracellular AA concentration more effectively than external AA (4.1 fold versus 2.3 fold) in human dermal fibroblasts (TIG118) [83]. The increase of intracellular AA by external AA was inhibited by phorbol 12-myristate 13-acetate and glucose, which are inhibitors of SVCTs and GLUTs, respectively, but the increase by ascorbyl 6-O-palmitate 2-phosphate was not affected, suggesting it is absorbed through simple diffusion. Ascorbyl 6-O-palmitate 2-phosphate was converted to AA by intracellular enzymes mainly through ascorbyl 6-O-palmitate (3) and partially through ascorbyl 2-phosphate (4).
In our study [84], ascorbyl 3-O-coumarate (5) and ascorbyl 2-O-coumarate (6) were synthesized as multifunctional cosmeceutical agents to inhibit melanin synthesis and in¬crease collagen synthesis. At 100 ^tM, ascorbyl 3-O-coumarate and ascorbyl 2-O-coumarate decreased the melanin content of human dermal melanocytes by 65% and 59%, respectively. At 100-300 the compounds augmented collagen synthesis in human dermal fibroblasts by 120〜144% and 125〜191%, respectively. They increased procollagen type I C-peptide release, and ascorbyl 2-O-coumarate decreased MMP1 level, indicating that they might regulate collagen metabolism by multiple mechanisms.
3-O-Ethyl ascorbic acid (7) is a stabilized form of AAZ and skin permeation can be enhanced by using a proper single solvent, such as glycerol, propylene glycol, and 1,2- hexanediol[85]. A serum containing 3-O-ethyl ascorbic acid (30%), lactic acid (1%), and other ingredients has been tested for safety and biological activities in HaCaT keratinocytes, human dermal fibroblasts, reconstructed human epidermis, and reconstructed human pigmented epidermis [86]. The serum reduced ultraviolet radiation (UV)-B-induced DNA damage and melanin synthesis and increased collagen production.
Multiple phase emulsions. Anhydrous vesicles, Nanoparticles, Liposomes, Spanlastic vesicles. Gels, Aptamers, Polyols



Figure 1.Various strategies to enhance the efficacy of ascorbic acid (AA) increasing dermal collagen. AA is present as ascorbate mono-anion (Asc-) at neutral pH. The efficacy of AA may be synergis¬tically enhanced by combined formulation with other active ingredients, such as other vitamins, amino acids, peptides, growth factors, and natural products. The incorporation of AA into multiple phase emulsions, anhydrous vesicles, nanoparticles, liposomes, spanlastic vesicles, gels enhances the stability and skin permeation of AA. Aptamers and polyols help stabilize AA. To enhance skin permeation of AA, its topical application can be combined with other procedures, such as iontophore¬sis, laser skin resurfacing, meso therapy, and the use of vibrating microneedles and photoacoustic waves. AA-loaded dissolving microneedle patches are also useful for this purpose. AA glycosides and hydrophobic AA precursors can be used instead of AA for higher stability in cosmetic products and a more effective supply of AA to skin cells. AA glycosides (AA-G) are enzymatically hydrolyzed to release AA as they pass through the skin. While AA enters cells through the SVCT family, hy¬drophobic AA precursors (AA-R) can enter cells through simple diffusion and be converted to AA by intracellular enzymes. In the process of collagen production, AA stimulates the mRNA expression of procollagen genes at the transcription stage. AA also enhances the hydroxylation of procollagen at the post-translational modification stage, by acting as a cofactor of 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase (Enz). AA reduces the iron ions at the active sites of the enzyme while it is oxidized to dehydroascorbate (DHA). DHA is enzymatically reduced to AA in a reaction coupled with the oxidation of glutathione (GSH) to glutathione disulfide (GSSG). GSSG is reduced to GSH in a reaction coupled with the oxidation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen (NADPH) to nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP+). Amino acids can serve as the building blocks of proteins needed at the translation stage. In particular, glycine, proline, and lysine, or their precursors, can help facilitate collagen production. 

Twenty-eight alkyl glyceryl AA derivatives were synthesized and tested in theophylline- stimulated B16 melanoma 4A5 cells to determine if they inhibit melanogenesis [82]. The longer the alkyl chains, the greater the melanogenesis inhibitory effects, but cytotoxicity also increased. 3-O-(2,3-dihydroxy propyl)-2-O-hexyl ascorbic acid (8) and 2-O-(2,3-dihydroxy propyl)-3-O-hexyl ascorbic acid (9) were selected as the optimized compounds for their inhibitory activities and low toxicities. Both compounds were more stable than AA.
AA was conjugated to squalene, a natural lipid of the skin, and the biological activity of AA-squalene conjugate (10) was investigated ex vivo in human skin explants [87]. AA- squalene conjugate (3%) significantly increased epidermal thickness and the expression of collagen III and glycosaminoglycans after application for 10 days, to a higher extent than free AA and ascorbyl 6-O-palmitate. It also increased the transcription of various ECM components in the epidermis and dermis than free AA and ascorbyl palmitate as well as the negative control.
Ascorbyl tetraisopalmitate (11),a liquid form AA precursor, protected UV-A-induced cytotoxicity in human keratinocytes, enhanced collagen production, and repressed MMP2 and MMP9 activities in human fibroblasts [88]. Its anti-wrinkle effect was evaluated in double-blind, randomized, placebo-controlled, split-face clinical trials, by applying either 1%, 2%, or 3% ascorbyl tetraisopalmitate cream on the periorbital area on one side of the face, and placebo cream on the other side of the face, for 8 weeks in 3 groups of 23 female subjects [89]. Each ascorbyl tetraisopalmitate cream significantly reduced periorbital wrinkles compared to the placebo although dose-dependency was not observed.
Ascorbyl 2-O-glucoside (12) stimulates collagen synthesis and exhibits antioxidant and antisenescence effects in human dermal fibroblasts [90,91].It is being used in cosmetics for various purposes, such as skin antiaging [92]. Because this compound has strong hy¬drophilicity, its skin permeability is lower than that of AA [93]. This compound is relatively stable in the cosmetic formulation and, when topically applied, it can be enzymatically hydrolyzed in the skin, producing AA [93,94].
In summary, certain hydrophobic AA precursors could be more effective than AA itself in increasing the concentration of AA in the cytoplasm because it is easy to pass through the cell membrane [83,88]. Topically applied AA glycosides can serve as a reservoir for AA because they continuously release AA by enzymatic hydrolysis in the skin [94]. Multifunctional hybrid compounds developed by covalently combining two substances with different biological activities and physicochemical properties would have added benefits [84,87].
6.2. Formulations to Improve the Stability and Skin Absorption of A A
Multiple phase emulsions of AA have been prepared for the enhanced stability and slow controlled release of the drug [95]. The oil/water/oil emulsions formulated from non¬ionic siliconized surfactants, sorbitan derivatives, and co-surfactants such as polyglycerol derivatives, using a two-step procedure, significantly increased the stability of AA, possibly through the entrapment of AA inside the reverse micelles surrounded by hydrophilic heads of surfactant. The in vitro release studies using Franz diffusion cell showed that about 14% of AA was released from the multiple phase emulsions in the first 4 h period with the release profile following zero-order kinetics.
Anhydrous formulations containing microfine particles of AA in an anhydrous oil/wax vehicle or an anhydrous silicone/oil/wax vehicle have been prepared to provide it greater stability than an aqueous vehicle [96]. The anhydrous formulations applied topically onto freshly excised human abdominal skin increased the production of collagen types I and III and cytokeratin within 48 h.
Aptamers are single-stranded DNA or RNA-based oligonucleotides that show specific binding affinity to a wide range of molecules [97]. The complex formation of AA with an optimized DNA aptamer enhanced its stability [98]. The complex reduced MMP1 expression and increased collagen synthesis in human dermal fibroblasts in vitro and improved wrinkles of the crow's feet in a clinical test undertaken with 22 female subjects for 8 weeks.
Some polyols used in cosmetics can extend the half-lives of AA, and the inclusion of glycerin improved the stability of AA in the water-in-oil emulsion more effectively than the inclusion of propylene glycol[79]. The photooxidation of AA was significantly slower in a gel preparation based on polyacrylic acid and glycerol compared to a single-component solution [99].
Various types of nanoparticles have been developed for the efficient and controlled delivery of AA and its derivatives [100,101].Stevanovic et al. produced copolymer poly (D, L-lactide-co-glycolide) (DLPLG) nanoparticles and encapsulated up to 15% of AA in the polymer matrix through homogenization of water and organic phases while preserving the spherical shape, size, and uniformity of nanoparticles [100]. Duarah et al. loaded AA into ethyl cellulose nanoparticles by the solvent evaporation method and formulated them with hydroxypropyl methyl cellulose gels [101].The optimized gel exhibited sustained AA release over 8 h in vitro.
Phosphatidylcholine liposomal formulation enhanced the penetration of sodium ascor¬bate ex vivo across the abdominal skin of human patients [102]. The sodium ascorbate- loaded phosphatidylcholine liposomes diffuse better through the dermis than the epider¬mis. The liposomes exhibited antioxidant and anti-inflammatory properties in human skin exposed to UV-A/UV-B radiation. The incorporation of AA into a negatively charged liposome increased the stability, skin permeation, and cell absorption of AAZ and exhib¬ited a higher collagen synthesis promoting effect than AA solutions [25]. The flux of AA through an excised pig ear skin was affected by liposome composition, and the presence of cholesterol and surface charge contributed to an increase in the amount of AA across the skin. This formulation promoted a 7-fold increase in drug flux compared to the free AA solution.
Starr et al. analyzed the three-dimensional skin permeation profile of AA and ascorbyl 2-O-glucoside in aqueous solutions or supramolecular hydrogel formulations in ex vivo porcine tissues using time of flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) [93]. The results showed that the skin absorption of AA and ascorbyl 2-O-glucoside was greatly enhanced when they were applied in the form of a supramolecular hydrogel containing an amphiphilic gemini imidazolium-based surfactant. Skin absorption of ascorbyl 2-O- glucoside was less than AA, but the former compound liberated the latter in the skin tissue, supporting the utility of ascorbyl 2-O-glucoside in continuously supplying AA for an extended time.
For the topical delivery of 3-O-ethyl 1-ascorbic acid, binary and ternary solvent systems have been developed by Iliopoulos et al.[103]. A binary mixture of propylene glycol and propylene glycol monolaurate effectively enhanced skin permeation of 3-O-ethyl ascorbic acid across the porcine skin compared with individual solvents. The optimized ternary solvent system containing propylene glycol: propylene glycol monolaurate: isopropyl myristate promoted up to 70.9% skin delivery of 3-O-ethyl ascorbic acid.
AA-loaded spanlastic vesicles prepared using an optimized ratio of span 60 and tween 60 (5:1) showed high entrapment efficiency, enhanced stability; good physicochemical sta¬bility; and improved drug penetration into the stratum corneum [104]. Topical application of AA-loaded spanlastic vesicles suppressed MMP2 and MMP9 expression in the skin and normalized epidermal thickness and the densely arranged dermal collagen fibers in rats exposed to UV-B radiation more effectively compared to AA solution.
In summary, the greatest challenge for cosmetic applications of AA is to maintain stability and improve delivery to the target site, which has been partially overcome by various advanced formulation technologies. In fact, these technologies are being applied to cosmetics [105]. In order to expand the industrial application of AA, continuous research and development for optimal formulations are required.
6.3. Use of Medical Devices to Enhance Skin Absorption ofAA
To enhance skin permeation of AA, topical application can be combined with other procedures, such as iontophoresis and laser skin resurfacing.
Ebihara et al. used radioactive [14C]-AA to trace iontophoresis-assisted drug absorp¬tion in rat skin [106]. The use of iontophoresis after topical application of AA markedly enhanced percutaneous drug absorption compared to a simple topical application. Ra¬dioactive tracer in the dermis reached a maximum level at 1 h after application. Hori et al. demonstrated that iontophoresis increased collagen production in rat skin as determined by hydroxyl proline level[107]. The collagen production was affected by the duration of iontophoresis and pulse types of electric stimulation. The frequent-reversal bipolar electric stimulation was more effective than a continuous unipolar pulse electric stimulation at increasing skin collagen content.
Skin pretreatment with lasers was shown to promote the transdermal delivery of AA derivatives, such as 3-O-ethyl ascorbic acid and ascorbic acid 2-O-glucoside [108]. When the stratum corneum layer in the skin female Balb nude mouse was partly ablated by erbium:YAG laser treatment, the flux of 3-O-ethyl ascorbic acid and ascorbic acid 2-O- glucoside was 105 to 189-fold and 35 to 78-fold higher, respectively, than their flux across intact skin. When the skin was treated with C〇2 laser, the flux of 3-O-ethyl ascorbic acid and ascorbic acid 2-O-glucoside was 181 to 277-fold and 82 to 117-fold higher, respectively; than their flux across intact skin.
Vibrating microneedles have been used to apply a 1.5% AA gel[109]. The vibrating microneedles enhanced the permeation of AA through the excised abdominal skin of the rat, in a manner dependent on the vibration intensity, application power, and AA gel application time [109]. Mesotherapy, a minimally invasive procedure involving a series of gentle, multiple micro-injections into the mesodermal layer under the skin, could be an additional option [110,111].
Photoacoustic waves, generated by laser pulses absorbed by piezophotonic (light-to- pressure) transducers, have been used to perturb the skin barrier and enhance skin delivery of ascorbyl 2-O-glucoside [112]. Exposure to photoacoustic waves for 5 min in combination with 2% ascorbyl 2-O-glucoside gel enhanced the drug delivery through the 760 ^tm thick pig skin samples by a factor of 15-fold with respect to passive delivery for 1 h contact of the formulation with the skin.
Thus, the use of medical devices or procedures has the advantage of enhancing the skin absorption of AA or its derivatives in a single- or multi-component preparation. However, medical devices or procedures would have limited access to ordinary consumers or patients if the devices are expensive or require technical skill in using them. In addition, caution is required because there is a risk that the use of electronic or mechanical devices causes side effects.
6.4. Antioxidant Effects of A A and Combination with Other Antioxidants
In the process of the interaction of internal and external factors, the skin undergoes various types of functional and structural degeneration associated with aging [18]. To delay or alleviate skin aging, the nutrition, energy, and redox balance of cells must be maintained in an optimal state [113]. For this purpose, the external supply of antioxidants such as AA is one of the attractive antiaging strategies [29]. AA (100 and 500 mM) treated on reconstituted human epidermis before or after UV irradiation at 120 mJ cm-2 attenuated cell death, apoptosis, ROS production, and tumor necrosis factor-oc expression [114].
As an antioxidant, AA can reduce the breakdown of collagen directly or indirectly. MMPs are zinc-containing endopeptidases involved in the degradation of collagen and other ECM components [15,16]. The activities of MMPs increase in aged skin [23,24,66]. ROS stimulates activator protein-1 and nuclear factor-KB, which in turn stimulate the expression of MMPs in epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts exposed to environmental factors, such as UV and particulate matter [19,115-117]. AA was shown to attenuate the expression of MMP1 and 2 induced by UV-A [118] or that of MMP1 and MMP 9 induced by the combination of UV-A and particulate matter in human dermal fibroblasts [119]. The effect of AA inhibiting the expression of MMPs is considered to be associated with its antioxidant and anti-inflammatory effects [120].
The antioxidant effect of AA will be enhanced when it is combined with other antiox¬idants with different redox potentials, such as <x-tocopherol[121,122]. The combination of AA with other vitamins, natural products, or peptides with different mechanisms of action synergistically protects cells from photooxidative stress [123], enhances collagen synthesis [72-74], and retards skin aging [71,75-77]. Since GSH and NADPH are used as electron donors for the enzymatic regeneration of AA, the biological effects of AA could be enhanced by combining AA with thiol compounds and nicotinamide. Research on the use of thiol compounds and nicotinamide as cosmeceuticals is actively underway [113,124].
The reason why various antioxidants with different redox potentials, mechanisms of action, and origins are used in combination is that it is expected that the biological effect will be better than when each antioxidant is used alone [125,126]. This is logical reasoning, but must be proven experimentally and clinically, because many antioxidants can act as pro-oxidants in some cases and increase oxidative stress in cells [127]. In addition, when antioxidants with chemical activity are formulated in a cosmetic preparation, they can affect the stability of the product [128]. Because prescribing multiple ingredients together has these advantages and disadvantages, caution is required in the selection of antioxidants to be combined with each other.
6.5. Combination of A A with Amino Acids to Synergistically Increase Collagen Production
Because ECM proteins, such as collagen and elastin, have unique amino acid compositions, their production in cells is influenced by the availability of specific amino acids [129-132]. Collagen proteins exist in the form of a triple helix, and the amino acid sequences repeat glycine-proline-X or glycine-X-hydroxyproline, where X is any amino acid [10]. Glutamine or glutamate increases proline production via pyrroline 5-carboxylate, and thereby collagen production in cells [133]. External proline supplementation increases collagen production, especially in glutamine-deficient media [134].
Because glycine residues occupy 1/3 of amino acid residues in collagen protein [10,13]/ the supply of glycine may be a limiting factor for collagen synthesis. A study by Paz- Lugo et al. [135] demonstrated that external glycine had a stronger effect on collagen production than prolinez lysinez and other amino acids in articular chondrocytes. In our study [136]z glycine enhanced collagen production most effectively among 20 different free amino acids in human dermal fibroblasts. In addition, glycinamide was the most effective among 20 different amidated amino acids. A surprising new finding was that glycinamide increased collagen production much more effectively than glycine. In contrast, other glycine derivatives, such as N-acetyl glycine, N-acetyl glycinamide, glycine methyl ester, glycine ethyl ester, and glycyl glycine, did not increase it. Thus, glycinamide is suggested to be an optimized form of glycine precursor to enhance collagen production in cells.
The combination of AA (1 mM) with glycinamide (1 mM) synergistically enhanced collagen production in human dermal fibroblasts to similar levels in cells treated with TGF- pl(10 ng mL-1)[136]. AA derivatives, such as ascorbyl 2-phosphate (Magnesium salt), 3-O-ethyl ascorbic acid, ascorbyl tetraisopalmitate, and ascorbyl 2-O-glucoside, enhanced collagen production and showed a synergistic effect when treated in combination with glycinamide. Thus, it is possible to synergistically improve collagen synthesis by combining AA analogs (i.e., AA and ascorbyl 2-phosphate) and glycine analogs (i.e., glycine and glycinamide)[136].
The characteristic of combination therapy is that, instead of using one compound at a high concentration, several compounds with different mechanisms of action are combined at low concentrations to achieve the same or higher clinical effect [137,138]. Considering that cell collagen production can be enhanced in the transcriptional or translational stage according to changes in the cellular microenvironment, the combination of the several compounds acting at different stages is expected to have the advantage of synergistically increasing collagen production in cells [21].It also has the advantage of avoiding the potential risk of side effects that each compound may cause at high concentrations [139]. However, the clinical utility of this combination therapy has not been established yet.
7. Discussion
Both intrinsic aging and extrinsic aging of the skin are mediated by oxidative stress and are accompanied by a decrease in the synthesis of ECM components and an increase in their decomposition. Therefore, the function of AA as an antioxidant and an enzyme cofactor is very important in maintaining skin health and preventing skin aging [28,29].
The results of several clinical trials suggest that AA and its precursor reduce wrinkles and increase the elasticity of the skin by preventing the loss of collagen in the process of photoaging and the natural aging of the skin [67-69,89]. External supplementation of AA can have a beneficial effect especially when the level of AA in the body is significantly lower than the normal state [67]. The skin collagen-enhancing effect of AA can be more apparent in patients with low collagen levels and people with photoaged or naturally aged skin [68]. On the other hand, when there is a sufficient amount of AA in the body, its supplementation may not be necessary and excessive administration could harm health [140]. Therefore, if the diagnosis of skin AA and collagen levels precedes, it is expected that the best clinical effect will be obtained by applying AA products customized to the patient.
The mechanism of action of AA promoting the production of functionally and struc¬turally mature collagen is well established [53-55]. AA acts as a cofactor of 2-oxoglutarate- dependent dioxygenases, such as prolyl 4-hydroxylase, prolyl 3-hydroxylase, and lysyl 5-hydroxylase, which catalyze the hydroxylation of proline and lysine residues of pro¬collagen [5,43]. On the other hand, although the action of the pharmacological dose of AA inducing the expression of collagen genes was discovered early in the 1980s [57,58], the detailed molecular mechanism remains to be further explored. Depending on the concentration, AA can function as either an antioxidant or a prooxidant and can directly activate transcription factors that control collagen gene expression by affecting cell signal transduction processes. Alternatively, AA can increase the expression of TGF-pl and activate the related signal transduction process to finally increase the gene expression of collagen. A comprehensive study examining these possibilities is needed.
In the process of collagen production, AA plays a critical role in the gene transcription stage and the post-translational modification stage but does not have a direct effect on the translation stage. On the other hand, the supply of amino acids can have a significant impact at the translation stage by providing the building blocks of proteins. Thus, it is possible to synergistically increase collagen production by combining AA and amino acids that act at different stages of the collagen production process. Our recent in vitro study using human dermal fibroblasts fully supports this notion [136]. The strategy to enhance cellular collagen production using AA analogs (such as AA and ascorbyl 2-phosphate) in combination with amino acid analogs (such as glycine and glycinamide) would be useful for skin antiaging purposes. Further studies are needed to verify the clinical utility and efficacy of this combination strategy.
8. Conclusions
The chemical instability of AA and the difficulty of skin absorption have limited its medical and cosmetic applications. To solve these problems and attain the highest efficacy, various strategies are being developed. The dermal collagen-enhancing and skin antiaging effects of AA are more evident in patients with low AA and collagen levels. The combination of AA analogs with amino acid analogs may open a new possibility to effectively enhance skin collagen production for antiaging purposes. Further in vivo and clinical studies are needed to validate this new strategy.
Funding: This work was supported by a National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korean government (Ministry of Science and ICT) (No. 2019R1I1A2A01045132), and a grant from the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (No. HP20C0004).
Conflicts of Interest: The author declares no conflict of interest.
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